Cerkiew św. Ducha została wymurowana w końcu XVI wieku. Na poczatku XVII wieku przy niej był klasztor, szkoła, szpital, biblioteka  i drukarnia,którą ufundował Radziwiłł Sierotka na poczaku XVII wieku. Drukarnia była  czynna do końca XIX wieku.Bractwo swietego  Ducha  przyjmowało za jeden ze swoich głównych celów obronę prawosławia przed wpływami katolicyzmu, czynnie sprzeciwiało się unii brzeskiej, wydawało we własnej drukarni liczne publikacje teologiczne i polemiczne. .Podziemia klasztornej cerkwi stały się  miejscem pochówku prawosławnych biskupów wileńskich. Po pożarze w XVIII wieku  Jan Krzysztof Glaubitz odbudowuje  wnętrze cerkwi w stylu baroku . W świątyni jest nietypowy rokokowy ikonostas, który w latach dziewięćdziesiątych  pomalowano na zielono. Centrum nawy zajmuje ozdobna raka, zawierająca relikwie świętych męczenników wileńskich: Jana, Antoniego i Eustachego, których ciała nie rozsypały się w proch od ponad sześciu wieków  „jako cud boży mocnej ich wiary w Chrystusa”, – jak powiadają prawosławni. Wnętrze cerkwi dekoruje wiele ikon. Jest nawet kopia Matki Boskiej Częstochowskiej i Matki Boskiej Ostrobramskiej, czczonych jako ikony. W 1845 z inicjatywy przełożonego, dotychczasową bramę wjazdową na teren klasztoru zastąpiła nowa, z wizerunkiem Chrystusa i sceną zesłania Ducha Świętego, wykonana w stylu staroruskim.   W cerkwi znajduje się 20 ikon autorstwa Iwana Trutniewa, w tym ikona Zwiastowania, ufundowana przez carycę Marię Aleksandrownę. W 1913 roku z inicjatywy metropolity Tichona (Bieławina) został wzniesiony dom pielgrzyma.  W cerkiewnym kramiku można nabyć nie tylko ikonki, ale też literaturę i  świeczki, które zapala się w intencji zdrowia dla żywych albo pokoju duszy zmarłych.

Monaster i cerkiew działały bez przeszkód przez cały okres istnienia ZSRR.

Cerkiew św. Ducha jest jedyną z 11 prawosławnych cerkwi Wilna, która nie uznała papieża i nie przyjęła Unii Brzeskiej.